Menentukan Ukuran Mikroorganisme
Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer.
Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif = 0,01 mm / 10 µm.
Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi
Penentuan ukuran mikroba
- Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.
- Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan
- Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.
- Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.
- Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.
Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :
x skala okuler X hasil kalibrasi
y skala okuler X hasil kalibrasi
misal : 5 X 1,54 = 7,7 µm
2 X 1,54 = 3,08 µm
A. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung)
a.1. Plate Count (hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung.
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml
CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran
Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan metode Spread Plate dan Pour Plate.
Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 0,1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml
SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml
= 5x108 CFU’s / ml
Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 1 ml
Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml
SP = 1 ml = 5x107 CFU’s / ml
Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistik untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan.
Syarat penghitungan SPC
Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Colony Counter.
a. Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.
- Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan rinse) (jika perlu).
- Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.
- Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan batang L atau glass beads.
- Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.
- Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan.
b. Most Probable Number (MPN)
Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr.
Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.
Cara kerja :
- Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar).
- Kocok botol yang berisi air sampel.
- Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis.
- Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis.
- Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis.
- Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.
- Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.
Pada pemeriksaan suatu produk, jumlah bakteri akan menggambarkan mutu bahan baku, proses pembuatan dan tingkat kerusakan suatu bahan makanan. Metode perhitungan sangat banyak, hanya biasanya metode yang dipilih adalah disesuaikan dengan kepentingan pemeriksaan, kecepatan dan ketepatan hasil pemeriksaan.
Metode perhitungan itu adalah:
(1) Metode hitung bakteri, metode ini dapat dikerjakan tergantung dari jumlah bakteri yang hidup dengan aktifitas metabolisme :
(a) angka lempengan total
(b) pengenceran, Most Probable Number (MPN)
(c) aktifitas metabolik
(2) Metode total bakteri hidup dan bakteri mati meliputi :
(a) berat kering bakteri
(b) kekeruhan, berdasarkan jumlah sinar yang diserap pada panjang gelombang tertentu
(c) hitung partikel elektronik
(d) hitung dengan mikroskop langsung
(e) volume sel (Anonim, 2007)
Dari sejumlah metode di atas beberapa saja yang sering digunakan untuk pemeriksaan rutin yaitu;
1. Angka lempeng total ”Pour Plate” digunakan untuk menghitung bakteri dengan ketentuan yaitu :
Satu koloni bakteri dihitung satu sel bakteri hidup, satu sel hidup dari sampel akan mampu membentuk koloni bakteri dalam lempeng petri dish, dan dihitung jumlah koloni antar 30-300 koloni. Apabila kurang maka dihitung jumlah koloni yang ada, sedang apabila lebih dari 300 maka perlu dilakukan pengenceran.
2. Penghitungan bakteri dengan bakteri ”Spread Plate”, prinsip hitung bakteri dengan metode ini adalah meratakan bakteri yang terdapat di dalam sampel dengan volume tertentu di atas permukaan media yang sesuai.
3. Most Probable Number (MPN), adalah perhitungan bakteri dengan cara menggunakan variasi jumlah tabung yang sudah ada di dalam standard (Anonim, 2007).
Slide spesial-counting Chambers sebagaimana penghitung bakteri Petroff-Hausser juga digunakan untuk membuat perhitungan langsung. Perhitungan bakteri ditempatkan pada sebuah jalur ruangan, dimensi dari yang kita tahu, dan dibungkus dengan yang kecil. Pengujian dapat di buat dengan lebih banyak kepuasan dengan lapangan-gelap atau fase mikroskopis, jika sel tidak ditandai dan karena itu tidak terlalu mencolok oleh pengujian terang-lapang. Sejak counting cahmber diputuskan mati di dalam area yang pasti dan sejak kedalaman dari perhitungan pada ruangan diperhitungkan di ketahui, berarti bahwa di atas volume lain daerah yang diatus dapat dijumlahkan. Semuanya adalah dibutuhkan, oleh karena itu, apakah dijumlahkan nomor dari organisme di beberapa area, rata-rata mendapatkan bilangan untuk menghitung per area, dan juga mengalikan rata-rata ini oleh sebuah faktor yang tepat memasukkan penjumlahan ke nomor bakteri per milimeter (Pelczar, etc. 1958).
Perhitungan Bakteri
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991).
Metoda APM adalah metoda untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statisitik.
Tabung positif ditunjukkan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas.
Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut :
a. Bakteri dalam contoh menyebar secara random;
b. Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah;
c. Organisma yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi;
d. Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi.
Di dalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran.
(http://journal.discoveryindonesia.com/PDFInterstitial,perhitungan+jumlah+mikroba.id)
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991).
Perhitungan Bakteri secara langsung
Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber) (Sutedjo, 1991).
Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang idup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat(Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991).
1. Berdasarkan kekeruhan
Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count)
Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
